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    茯苓止痒丸的质量标准研究

    发布时间:2019-10-27 来源:www.boshuolunwen123.com  作者:博硕论文辅导网

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    茯苓止痒丸的质量标准研究
    学术诚信声明

    本人所呈交的毕业论文,是在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本论文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确的方式标明。本毕业论文的知识产权归属于培养单位。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

    本人签名:                       日期: 2014.5.6

     

    [摘要]目的:建立茯苓止痒丸的质量控制方法。方法:采用薄层色谱法(TLC法)对茯苓止痒丸中的苍术、黄柏、甘草等三味中药进行鉴别;采用高效液相色谱法(HPLC法)对茯苓止痒丸中黄柏中的盐酸小檗碱进行含量测定。结果:苍术、黄柏、甘草具有鉴别特征,阴性无干扰。盐酸小檗碱在0.4152~2.076mg的范围内呈良好的线性关系,r =0.99995,平均加样回收率为99.37%,RSD=0.36%。结论:此方法简单便捷,准确度高,重现性好,可作为茯苓止痒丸的质量控制标准。
    [关键词]茯苓止痒丸;薄层色谱;高效液相色谱;盐酸小檗碱;质量标准

    Study on the Quality Standard of Fuling Zhiyang Pill

    [Abstract Objective] To establish the quality standard of Fuling Zhiyang Pill. Methods:  The three components-Atractylodis Rhizoma, Phellodendri Chinensis Cortex and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Fuling Zhiyang pill were qualitatively by TLC. The content of Berberine hydrochloride in Fuling Zhiyang pill was determined by HPLC. Results: The TLC spots of Glycyrrhizae Radix, Atractylodis Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex et Rhizoma were clear with good resolution and free of interference of negative samples. The linear ranges of Berberine hydrochloride was 0.4152~2.076mg,  R2=0.99995, the average recovery rate was 99.37%, the RSD was 0.36%. Conclusion: The method is simple, rapid, sensitive, accurate and reliable, which can be used to control the quality of Fuling Zhiyang pill.
    [Key Words] Fuling Zhiyang pill, TLC, HPLC, Berberine hydrochloride, quality standard


                                      目录
    前  言 1
    1 研究进展及背景 2
    1.1茯苓止痒丸中各药的主要成分及药理作用研究进展 2
    1.2我国中药质量标准研究进展 2
    1.2.1我国中药质量标准研究现状 2
    1.2.2中药质量标准的主要研究内容和控制模式 3
    1.2.3中药质量标准检测仪器的研究进展 3
    1.2.4中药质量标准检测方法的研究进展 3
    1.3盐酸小檗碱的含量测定方法的研究进展 4
    1.4研究的目的与意义 5
    1.4.1研究的目的 5
    1.4.2研究的意义 5
    2 仪器与试药 6
    2.1仪器 6
    2.2 试药 6
    3 定性鉴别 6
    3.1 苍术的TLC鉴别 6
    3.2 黄柏的TLC鉴别 7
    3.3 甘草的TLC鉴别 8
    4 茯苓止痒丸中盐酸小檗碱的含量测定 9
    4.1高效液相色谱条件 9
    4.2 对照品溶液的制备 10
    4.3 供试品溶液的制备 10
    4.4 阴性对照溶液制备 10
    4.5 测定 10
    4.6 线性关系考察 11
    4.7 精密度考察 12
    4.8 重现性试验 12
    4.9 稳定性试验 13
    4.10 加样回收试验 14
    4.11 茯苓止痒丸中盐酸小檗碱的含量测定结果 14
    5 检 查 15
    5.1 外观性状 15
    5.2 装量差异 15
    5.3 崩解时限 15
    6.讨论 16
    6.1 薄层色谱鉴别方法学考察 16
    6.1.1苍术的薄层鉴别方法学考察 16
    6.1.2黄柏的薄层鉴别方法学考察 17
    6.1.3甘草的薄层鉴别方法学考察 18
    6.2高效液相色谱的方法学考察 19
    6.2.1色谱条件的考察 19
    6.2.2 供试品的制备方法学考察 19
    结  论 20
    参考文献: 21
    致  谢 23

                            前  言
    脂溢性皮炎是皮肤科临床的常见病、多发病,也是临床的难治性疾病。该病病因复杂、反复发作;祖国医学认为过食辛辣、肥腻、甜品,或情志失调、起居失节以致湿热内蕴是脂溢性皮炎发生的主要原因。临床上脂溢性皮炎病人皮疹以附着油腻性鳞屑的红斑、丘疹为主,多伴口苦、纳呆、便秘、舌红、苔黄腻,脉弦滑数,辨证多为湿热蕴结,故治疗上应以清热燥湿、凉血解毒为主。茯苓止痒丸具有清热燥湿、凉血解毒的功效。用于脂溢性皮炎、慢性湿疹、银屑病等由湿热蕴结引起的皮肤病疗效确切。
    茯苓止痒丸根据元朝朱震亨所著《丹溪心法》中的经典方剂二妙散为基本方加减后成方,主要用于治疗湿热蕴结引起的脂溢性皮炎,由土茯苓、槐花、黄柏、苍术、甘草、防风、赤芍等七味中药组成。本方中以土茯苓清热解毒祛湿为君药,配合苍术燥湿健脾、黄柏清热燥湿解毒为臣药;再佐以槐花凉血解毒;甘草调和诸药[1,2]为使。诸药合用,共奏清热燥湿、凉血解毒的功效,治疗脂溢性皮炎、慢性湿疹、银屑病等由湿热蕴结引起的皮肤病有良好的疗效。
    中药质量标准是以中医药理论体系为指导,结合现代仪器分析手段和方法研究分析中药制剂的质量,对保障临床用药安全、有效、稳定具有重要意义[3]。质量标准的制定有利于促进中药达到优质、高效、合理、可控的标准, 从而真正的实现中药现代化和标准化[4]。
    因此,通过实验对茯苓止痒丸进行质量标准研究,拟定科学可靠的质量控制标准,可为制定其质量标准提供依据,从而保证其临床用药的有效性、稳定性和安全性。

    1 研究进展及背景
    1.1茯苓止痒丸中各药的主要成分及药理作用研究进展
    茯苓止痒丸由土茯苓、苍术、防风、赤芍、槐花、黄柏、甘草七味中药组成。本方中以土茯苓清热解毒祛湿为君药,配合苍术燥湿健脾、黄柏清热燥湿解毒为臣药;再佐以槐花凉血解毒;甘草调和诸药[1,2]为使。诸药合用,共奏清热燥湿、凉血解毒的功效。
    其中,土茯苓含多种化学成分, 有糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮和黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等。其具有利尿、镇痛、抗炎和免疫、抗痛风性关节炎等药理作用[5]。
     黄柏主要含异喹啉类生物碱,为主要活性成分,主要为小檗碱,黄柏碱、木兰碱、掌叶防己碱(棕榈碱)等。另含黄柏酮、黄柏内酯、白鲜内酯、青荧光酸、豆甾醇等成分。其中小檗碱有抗菌、降压等药理作用,黄柏碱有中枢神经系统抑制作用[6]。
             苍术主要有效成分为挥发油,主要包括苍术醇(Atractylol)、苍术酮( Atractylone)、茅术醇(Hinesol)、β-桉叶醇(B-Eudesmol) 等。药理学研究表明,苍术的药理活性显著且广泛,主要具有抗心律失常、降血糖、利尿、促进胃排空、抗溃疡、降血压、保肝、抗炎、抗菌等药理作用[7]。
        甘草中主要包含黄酮类、三萜类、多糖类等有效成分,其药理作用研究主要集中在甘草酸、甘草次酸、甘草黄酮及甘草多糖等成分。具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[8]。
    槐花主要成分是芦丁(Rutin),并含有多种生物活性物质, 其有效成分包括三萜皂苷类,脂肪酸和β- 谷甾醇,鞣质、染料木素等,具有有抗菌、抗炎、致突变、抗病毒、凝血、止血、解痉、抗溃疡等药理作用[9]。
       1.2我国中药质量标准研究进展
    1.2.1我国中药质量标准研究现状
        我国中药质量控制须按照法定的中药质量标准进行,现行中药质量标准包括2010 年版《中国药典》、卫生部中药成方制剂标准、地方标准上升国家标准、保健药品升为国家药品标准及尚未统计的新药转正标准等,共计1 万多个,主要包括以下特点:中药标准多以定性为主,缺少量化指标;偏重单一成分分析,不能完全代表中药疗效;测定品种不够全面,重金属和农药残留的限度测定要求较低,品种过少[10,11]。
     1.2.2中药质量标准的主要研究内容和控制模式
         我国中药质量标准研究的主要研究对象是中药材和中药制剂,研究内容主要包括性状、鉴别、浸出物、检查、含量测定、药用部位、采收加工、炮制、功能与主治等[12]。
        我国现行的中药复方制剂质量控制模式主要包括化学定性鉴别与指标成分的含量测定两个方面,结合中药复方制剂的研究实际,在定性鉴别中主要运用色谱鉴别、理化鉴别与显微鉴别。这种模式是借鉴化学药品质量控制模式建立的,即通过测定某样单一的“指标成分”、“有效成分”或“活性成分”建立相应的定性、定量标准来控制中药制剂的质量,这也是现在乃至将来很长一段时间内中药质量控制的主流[11、13]。
    1.2.3中药质量标准检测仪器的研究进展[14]
        随着科学技术的发展,更先进的分析仪器逐渐运用于中药质量标准的制定中,使中药分析与中药质量评价越来越规范化和自动化。2005年版中国药典(一部)附录中收载的中药质量标准中使用的现代分析仪器主要为光谱仪和色谱仪,光谱仪主要包括:红外分光光度计、紫外-可见分光光度计、原子吸收分光光度计等。色谱仪主要包括:高效液相色谱仪、气相色谱仪、薄层色谱、薄层色谱扫描仪等。2010年版中国药典在2005年版中国药典的基础上新增了核磁共振波谱仪、液相色谱-质谱联用仪、拉曼光谱仪等现代化分析仪器[14]。
    1.2.4中药质量标准检测方法的研究进展[13-17]
    随着现代科学的进步,综合分析技术是一种能较好反映中药制剂整体质量的综合分析方法和质量标准模式的现代技术,能对中药制剂质量进行系统、具体、全面的研究,以达到对复杂体系质量可控的要求。但是,中药的成分复杂, 目前的中药质量标准研究检测仍将以某一种或少数几种有效成分或指标性成分的定性定量分析为主, 但是随着现代自然科学技术的发展, 物理、化学、生物学和计算机等学科的渗透, 带来了许多新的实验方法。
        2010年版《中国药典》一部附录中收载的现代仪器分析技术除了分光光度法、色谱法和质谱法外,在2005年版药典的基础上,中药品种中新增了液相色谱-质谱联用、DNA 分子鉴定、薄层-生物自显影技术等方法。此外,现有的质量标准检测方法还有热分析法、电分析法(EA)、分子生物学技术、计算机辅助技术、化学计量学方法等。从色谱法中薄层色谱、薄层扫描色谱法的不断发展完善, 到现代的高效液相色谱技术和气相色谱技术在中药质量标准控制中的广泛应用和2010年版药典新增的离子色谱法,都显示了现代色谱分析新技术得到进一步的扩大应用。中药指纹图谱技术以综合的质量评价模式使中药的质量评价从分解式的单一成分的“微观分析”向群体成分的“宏观分析”发展。一测多评法通过采用一种内参物检测多种组分,节约、准确,可实现多指标同步控制,已得到广泛认可和应用,并收载于2010年版《中国药典》一部。色谱与光谱以及质谱的技术联用甚至是多维联用技术也成为中药质量标准中质量分析的一个发展趋势。如气相色谱-质谱联用法(GC/ MS)、液相色谱-质谱联用法(LC/ MS)、二维液相色谱法(2DLC)等。
    含量测定是中药复方制剂质量控制和质量标准研究的核心,最常用的方法为光谱法与色谱法。中药制剂成分较为复杂,分离难度高,色谱法既能较好地分离各种待测成分又能准确地定量分析,故所得效果令人较为满意,应用也最为普遍。
    1.3盐酸小檗碱的含量测定方法的研究进展
        目前而言,复方制剂中含有黄柏的盐酸小檗碱含量测定方法有紫外-可见分光光度法(UV)、薄层扫描法(TLC)、原子吸收分光光度法(AAS)、二阶导数光谱法(SDS)、毛细管电泳法(HPCE)、高效液相色谱法(HPLC)[18]等,其中高效液相色谱法最为普遍。
        HPLC法测定盐酸小檗碱含量研究的文献较多,其中王迎[19]建立了反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定耳聋通窍丸中盐酸小檗碱的含量的方法,采用色谱柱Kromasil C-18 柱,以乙腈-0.1%磷酸溶液(40∶60)(每100 毫升加十二烷基磺酸钠0.1 g)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL,用紫外检测器于265nm 波长处检测,结果盐酸小檗碱的线性范围为10.11-50.55 μg/mL,平均回收率为98.9%,相对标准偏差为0.8%,且重现性和准确性良好,峰形及柱效佳。叶秀金等[20]研究建立了HPLC测定清肺抑火丸中盐酸小檗碱的含量的方法,汪艳[21]建立了HPLC法测定金花消痤丸中盐酸小檗碱的含量的方法,结果较为满意。李桂峰等[22]研究建立了高效液相色谱法测定妇炎康滴丸中盐酸小檗碱的含量的方法,张飞[23]建立了高效液相色谱法测定炎可宁片中盐酸小檗碱的含量的方法,利用HPLC法较高的分离特点,分离出制剂中的黄柏中的盐酸小檗碱,较好地控制了制剂的质量。
        大量的文献事实证明[18-23],高效液相色谱法在复方中药制剂中的盐酸小檗碱的含量测定中,具有分离效率高,分析速度快,重现性好,专属性强等优点,广泛应用于药物分析中,特别适合复方制剂中的多种成分的分离。其中《中国药典》2010年版一部中所收载的黄柏中的盐酸小檗碱的含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g)为流动相,并在265nm波长下检测。唐艳梅 [24]等对此色谱条件进行了验证,并对提取溶剂进行筛选,实验表明在此色谱条件下以流动相为提取溶剂,所得结果重现性好,精密度高,分析快速准确,分离效果佳。
    高效液相色谱法可使盐酸小檗碱色谱峰与中药制剂中其它成分色谱峰分离良好,保留时间适中,峰形对称,重现性好,适用于茯苓止痒丸中盐酸小檗碱的含量测定。
    1.4研究的目的与意义
    1.4.1研究的目的
    通过建立茯苓止痒丸中多味药的薄层色谱鉴别方法及盐酸小檗碱的高效液相含量测定方法,为制定其质量标准提供依据,为药品质量检查提供方法支持,控制茯苓止痒丸的质量,保证制剂质量,确保该方疗效。
    1.4.2研究的意义
       为了更好的地控制茯苓止痒丸的质量,通过实验研究,拟定科学可靠的质量标准控制方案,从而保证其临床用药的有效性和安全性。
       2 仪器与试药
    2.1仪器
    CN61M/SKZ2TDⅡ型全自动薄层铺板仪(北京爱格森自动化有限公司);
    Mettler-Toledo XS205DU电子分析天平(瑞士)
    DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);
    MilliPore Advantage A10 自动纯水机(美国);
    CAMAG TLC SAMPLER 4型 全自动薄层色谱点样仪 (瑞士);
    CAMAG  Reprostar 3数码成像系统(瑞士);
    HH.S21-Ni8电热恒温水浴锅(北京);
    Waters 2695-2998高效液相色谱仪(上海);
    HK-400DB型数控超声波清洗器(杭州)。
    2.2 试药
    苍术对照药材(121156-201101),黄柏对照药材(120304-201204),甘草对照药材(121037-201108),盐酸小檗碱对照品(110793-201211),均购自中国药品生物制品检定所;茯苓止痒丸(20120530、20120802、20121129)由广东省中医药工程技术研究院中药制剂研究室提供。乙腈和甲醇均为色谱纯级别(默克化工),薄层鉴别用水为广东省中医药工程技术研究院中药制剂研究室自制,高效液相用水为屈臣氏纯净水,其它薄层使用的试剂均为分析纯级别。

    3 定性鉴别
    3.1 苍术的TLC鉴别
    取茯苓止痒丸样品适量,研碎,称取均匀粉末4g,加入乙醇50ml,超声提取30min,过滤取滤液,水浴蒸干,所得残渣加水10ml溶解,用石油醚(60~90℃)振摇萃取2次,每次加入提取溶剂15ml,合并石油醚层,水浴蒸干,所得残渣加入甲醇1ml定容,作为苍术供试品溶液。另取苍术对照药材0.5g,加50ml水煮,微沸一小时,过滤,水浴蒸干,残渣用硅藻土拌匀,蒸干,之后同供试品制备方法制成苍术对照药材溶液。按茯苓止痒丸制备工艺制作缺苍术药材的阴性对照样品,称取粉末4g,同茯苓止痒丸供试品溶液制备方法制成苍术阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验,分别吸取茯苓止痒丸供试品溶液和阴性对照溶液各20μl,对照药材5μl,点于由广东省中医药工程技术研究院中药分析研究室自制的硅胶GF254薄层板上使成条带状,以石油醚(60~90℃)—丙酮(9∶1)为展开剂,于展开缸中展开至8cm,取出,自然晾干,均匀喷以5%香草醛硫酸溶液显色,于105℃烘箱中加热约2分钟至斑点显色清晰,于日光下检视。在茯苓止痒丸供试品色谱中,与对照药材色谱相应的位置上,有一个显相同颜色的紫色清晰斑点,且阴性无干扰。结果见图1。

    3.2 黄柏的TLC鉴别
    取茯苓止痒丸样品适量,研碎,称取均匀的粉末1g,加入甲醇20ml,超声提取30min,过滤取滤液,滤液水浴蒸干,所得残渣加入甲醇5ml定容,作为黄柏供试品溶液。另取黄柏对照药材0.05g,加30ml水煮,微沸一小时,过滤,滤液水浴蒸干,残渣用硅藻土拌匀,蒸干,之后同茯苓止痒丸供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按茯苓止痒丸制备工艺制作缺黄柏药材的阴性对照样品,称取粉末1g,同供试品溶液制备方法制成黄柏阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验,分别吸取上述三种溶液1μl,点于由广东省中医药工程技术研究院中药分析研究室自制的硅胶GF254薄层板上使成条带状,以正丁醇—冰醋酸—水(7∶1∶2)为展开剂,置展开缸里展开至8cm,取出,自然晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。在茯苓止痒丸供试品色谱中,与对照药材色谱相应的位置上,有一个显相同颜色的黄色清晰荧光斑点,且阴性无干扰。结果见图2。

    3.3 甘草的TLC鉴别
    取茯苓止痒丸样品适量,研碎,称取均匀的粉末5g,加入甲醇40ml,超声提取30min,过滤取滤液,水浴蒸干滤液,所得残渣加入水20ml使溶解,加入盐酸调节溶液pH值2-3,用乙酸乙酯振摇萃取2次,每次加入提取溶剂25ml,合并乙酸乙酯层,水浴蒸干,所得残渣加入甲醇1ml定容,作为甘草供试品溶液。另取甘草对照药材0.5g,加30ml水煮,微沸一小时,过滤,滤液水浴蒸干,残渣用硅藻土拌匀,蒸干,之后同供试品制备方法制成对照药材溶液。按茯苓止痒丸制备工艺制作缺甘草药材的阴性对照样品,称取粉末5g,同供试品溶液制备方法制成甘草阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验,分别吸取上述三种溶液5μl,由广东省中医药工程技术研究院中药分析研究室自制的硅胶GF254薄层板上使成条带状,以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(7∶3∶0.2)为展开剂,置展开缸中展开至8cm,取出,自然晾干,均匀喷以适量2%对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液显色,在105℃烘箱中加热约1分钟,立即置于紫外光灯(365nm)下检视。在茯苓止痒丸供试品色谱中,与对照药材色谱相应的位置上,有一个显相同颜色的蓝色荧光斑点,且阴性无干扰。结果见图3。

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